Sulfonamit trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sulfonamits in fishery products - Method for quantitative analysis by High Performance Liquid Chromatography

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng nhóm chất sulfonamit (gồm: sulfađiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfamethazin, sufamethoxypiriđazin, sulfacloropyriđazin, sulfađoxin, sulfamethoxazoll, sulfadimethoxin và sulfachinoxalin) trong sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp nhỏ hơn 5 mg/kg.

2 Phương pháp tham chiếu

Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp xác định hàm lượng các chất nhóm sulfonamit của Trung tâm nghiên cứu Nestle (Determination of Sulfonamide residues/Jean-Marc Diserens and Marie-Claude Savoy-Perroud/Quality and Safety Assurance Department/ Nestle' Research Center)

3 Nguyên tắc

Các chất nhóm sulfonamit có trong mẫu sản phẩm thủy sản được chiết tách bằng hỗn hợp axetonitril và điclorometan. Dịch chiết sau khi cô cạn cho tác dụng với dung dịch fluorescamin để tạo dẫn xuất huỳnh quang. Hàm lượng các dẫn xuất được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn.

4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.1 Thiết bị, dụng cụ

4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang.

4.1.2 Cột sắc ký pha đảo C18, kích thước cột L x ID: 250 x 3 mm, kí hiệu 100-5 C18 AB, loại Nucleosil.

4.1.3 Máy nghiền đồng thể, tốc độ 6 000 - 30 000 vòng/phút (KCH-1000).

4.1.4 Bể điều nhiệt hoạt động ở nhiệt độ 20 -100^oC (GRANT Y14).

4.1.5 Máy lắc, tốc độ 50 - 500 vòng/phút (IKA ề KS 260 basic).

4.1.6 Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút (Sigma 4K15).

4.1.7 Máy rung trộn mẫu (HWASHIN technology Co. 250VM).

4.1.8 Bình khí nitơ tinh khiết 99,999 %.

4.1.9 ống ly tâm thủy tinh dung tích: 15, 25 và 50 ml.

4.1.10 Pasteur pipet với quả bóp cao su.

4.1.11 Pipet định mức 5 và 10 ml.

4.1.12 Bình định mức dung tích: 10; 20; 25; 100; 500 và 1000 ml.

4.1.13 Giấy lọc 0,45 mm.

4.1.14 Cốc có mỏ dung tích 250 ml.

4.2 Hoá chất

Hoá chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích, gồm:

4.2.1 Axetonitril (CH₃CN) dùng cho HPLC.

4.2.2 Ðiclorometan (CH₂Cl₂) dùng cho HPLC.

4.2.3 Metanol (CH₃OH) dùng cho HPLC.

4.2.4 Axeton dùng cho HPLC.

4.2.5 Nước cất dùng cho HPLC.

4.2.6 Axit phosphoric (H₃PO₄) đậm đặc dùng cho HPLC.

4.2.7 Ðinatri hyđro phosphat (Na₂HPO₄).

4.2.8 Axit xitric.

4.2.9 Natri hyđroxit (NaOH.

4.2.10 Tác nhân tạo dẫn xuất fluorescamin (Fluram).

4.2.11 Chuẩn các chất nhóm sulfonamit.

4.2.12 Chuẩn nội sulfanilamit.

4.3 Dung dịch thử và dung dịch chuẩn

4.3.1 Các dung dịch natri hyđroxit

4.3.1.1 Dung dịch natri hyđroxit 10 M: hòa tan 40 g NaOH (4.2.9) trong nước cất (4.2.5) để có 100 ml.

4.3.1.2 Dung dịch natri hyđroxit 1 M: hòa tan 4 g NaOH (4.2.9) trong nước cất (4.2.5) để có 100 ml.

4.3.1.3 Dung dịch natri hyđroxit 0,1 M: pha loãng 1 ml dung dịch NaOH 1 M (4.3.1.2) trong nước cất (4.2.5) để có 10 ml.

4.3.2 Dung dịch axetonitril/H₃PO₄ pH = 6,0

Cho 80 ml axetonitril (4.2.1) và 20 ml H₃PO₄0,02 M (4.3.8.1) vào cốc 250 ml. Dung dịch này được để nguội tới nhiệt độ trong phòng. Dùng dung dịch natri hyđroxit 1 M (4.3.1.2) hoặc dung dịch natri hyđroxit 0,1 M (4.3.1.3) chỉnh pH = 6,0 0,1.

4.3.3 Dung dịch đệm xitrat 0,5 M, pH = 3,0

Hòa tan 10,5 g axit xitric (4.2.8) với 100 ml nước cất (4.2.5), chỉnh pH = 3,0 0,1 bằng dung dịch natri hyđroxit 10 M (4.3.1.1), dung dịch natri hyđroxit 1 M (4.3.1.2) và dung dịch natri hyđroxit 0,1 M (4.3.1.3).

4.3.4 Dung dịch đệm cho sự tạo dẫn xuất: trộn theo thể tích gồm 6 phần axetonitril/H₃PO₄ pH = 6,0 (4.3.2) với 4 phần dung dịch đệm xitrat 0,5 M, pH = 3,0 (4.3.3).

4.3.5 Dung dịch fluorescamin 10 mg/ml: hòa tan 50 mg tác nhân tạo dẫn xuất fluorescamin (4.2.10) trong 5 ml axeton (4.2.4).

4.3.6 Các chất thuộc nhóm sulfanilamit

4.3.6.1 Dung dịch chuẩn nội sulfanilamit 1 mg/ml: hòa tan 10 mg chuẩn nội sulfanilamit (4.2.12) trong 10 ml metanol (4.2.3).

4.3.6.2 Dung dịch chuẩn nội sulfanilamit 50 mg/ml: hút 1 ml sulfanilamit 1 mg/ml (4.3.6.1) vào bình định mức 20 ml rồi định mức tới vạch bằng metanol (4.2.3).

4.3.6.3 Dung dịch chuẩn nội sulfanilamit 5 mg/ml: pha loãng 1 ml sulfanilamit 50 mg/ml (4.3.6.2) với nước cất (4.2.5) để có 10 ml.

4.3.7 Các dung dịch chuẩn

4.3.7.1 Dung dịch chuẩn gốc các sulfonamit 100 mg/ml: cân lần lượt 10,0 mg từng loại các chất nhóm sulfonamit (4.2.11). Sau đó, hòa tan rồi định mức đến vạch 100 ml bằng metanol (4.2.3).

4.3.7.2 Dung dịch chuẩn các sulfonamit trung gian 1000 ng/ml: hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc các sulfonamit 100 mg/ml (4.3.7.1) vào các bình định mức 100 ml. Sau đó, định mức đến vạch bằng metanol (4.2.3).

4.3.7.3 Các dung dịch chuẩn sulfonamit để dựng các đường chuẩn: 0; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; và 10,0 ng/ml)

Hút lần lượt 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 và 5,0 dung dịch các sulfonamit 1000 ng/ml (4.3.7.2) vào bình định mức 500 ml. Sau đó, định mức tới vạch bằng metanol (4.2.3).

4.3.8 Pha động

4.3.8.1 Dung dịch H₃PO₄ 0,02 M: hòa tan 2,3 g H₃PO₄ 85% (4.2.6) với nước cất (4.2.5) rồi định mức thành 1000 ml.

4.3.8.2 Hỗn hợp dung dịch metanol và axcetonitril (tỷ lệ1:1): hòa tan 500 ml metanol (4.2.3) trong 500 ml axetonitril (4.2.1).

5 Phương pháp tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

5.1.1 Nghiền ít nhất 200 g mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.3). Cân chính xác 5,0 g mẫu đã được nghiền (kí hiệu W) cho vào ống ly tâm thủy tinh 25 ml (4.1.9).

5.1.2 Thêm 10 ml axetonitril (4.2.1) và 2,5 ml điclorometan (4.2.2) vào ống ly tâm thủy tinh 25 ml có chứa 5,0 g mẫu thử (5.1.1). Sau đó, lắc ống trong 10 phút trên máy lắc (4.1.5). Tiếp theo ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 6 000 vòng/phút.

5.1.3 Dùng pasteur pipet hút lớp trên vào bình định mức 25 ml (4.1.12). Thực hiện lại bước chiết ở Ðiều 5.1.2 rồi gom tất cả phần dịch chiết vào bình định mức 25 ml (4.1.12), làm đầy tới vạch định mức bằng axetonitril (4.2.1).

5.1.4 Hút chính xác 10 ml dịch chiết ở Ðiều 5.1.3 cho vào ống nghiệm thủy tinh 15 ml (4.1.9) để bay hơi tới cặn khô bằng dòng khí nitrogen (4.1.8) ở nhiệt độ 50^oC trên bể điều nhiệt (4.1.4).

5.2 Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu thủy sản đã được xác định không có các chất nhóm sulfonamit. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng như chuẩn bị đối với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1.

5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100 ng/g

Thêm chính xác 500 ml dung dịch các chuẩn sulfonamit trung gian 1000 ng/ml (4.3.7.2) vào 5g mẫu trắng. Tiến hành chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi 100 ng/g như chuẩn bị đối với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1.

5.4 Chuẩn bị dung dịch dựng đường chuẩn

Hút chính xác 10 ml lần lượt các dung dịch chuẩn sulfonamit để dựng các đường chuẩn (4.3.7.3) vào ống nghiệm thủy tinh 15 ml. Sau đó, cho dung dịch bay hơi tới cặn khô dưới dòng khí nitrogen (4.1.8) ở nhiệt độ 50^oC trên bể điều nhiệt (4.1.4). Tiếp tục thực hiện bước tạo dẫn xuất huỳnh quang qui định tại Ðiều 5.5.

5.5 Tạo dẫn xuất huỳnh quang

Thêm vào các ống nghiệm chứa mẫu đã chuẩn bị tại các Ðiều 5.1.4, 5.2 và 5.3 các dung dịch gồm: 1 ml dung dịch đệm tạo dẫn xuất (4.3.4), 20 ml dung dịch chuẩn nội sulfanilamit 5 mg/ml (4.3.6.3) và 0,2 ml dung dịch fluorescamin 10 mg/ml (4.3.5). Sau đó, để cho phản ứng khoảng 30 - 50 phút ở nhiệt độ trong phòng, rồi lọc qua giấy lọc 0,45mm (4.1.13). Lấy 10 ml dung dịch này tiêm vào hệ thống HPLC.

5.6 Tiến hành phân tích trên HPLC

5.6.1 Ðiều kiện phân tích

a. Cột sắc ký: cột Nucleosil 250 x 3 mm 100-5 C18 AB (4.1.2).

b. Chương trình pha động: theo qui định trong Bảng 1.

Bảng 1 - Chương trình pha động

Thời gian	Dung dịch H₃PO₄ 0,02 M	Hỗn hợp dung dịch metanol và axcetonitril (tỷ lệ1:1)
Bắt đầu	60	40
20 phút	60	40
25 phút	50	50
39 phút	50	50
40 phút	45	55
50 phút	45	55
51 phút	60	40
58 phút	60	40

c. Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút.

d. Thể tích tiêm: 10 ml.

đ. Bước sóng kích thích: l = 405 nm.

e. Bước sóng phát xạ: l = 495 nm.

5.6.2 ổn định cột sắc ký trong 30 phút tại chế độ làm việc.

5.6.3 Tiêm các dung dịch chuẩn đã được tạo dẫn xuất huỳnh quang (5.5). Dựng đường chuẩn giữa tỷ số diện tích pic các chuẩn sulfonamit/diện tích pic chuẩn nội sulfanilamit và nồng độ theo quan hệ tuyến tính bậc nhất (phương trình Y = ax + b).

5.6.4 Tiêm các dịch mẫu trắng, dịch mẫu xác định độ thu hồi và dịch mẫu thử đã tạo dẫn xuất huỳnh quang (5.5) vào hệ thống HPLC, mỗi mẫu 2 lần. Xác định tỉ số diện tích pic sulfonamit/sulfanilamit. Tính toán kết quả theo Ðiều 6.

5.7 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích

5.7.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm

Ðộ lệch chuẩn (CV_S) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%.

5.7.2 Ðộ thu hồi (R)

Ðộ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu phải nằm trong khoảng 60 -70 %.

6 Tính kết quả

Hàm lượng sulfonamit có trong mẫu được tính theo công thức sau:

M (mg/kg) = C x ----------

Trong đó:

- M là hàm lượng sulfonamit có trong mẫu, tính theo mg/kg;

- C là nồng độ của từng chất thuộc nhóm sulfonamit thu được (5.6.4), tính theo ng/ml;

- V là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử (5.5), tính theo ml;

- W là khối lượng mẫu thử (5,0 g).

28 TCN196 : 2004: Sulfonamit trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.