Hàm lượng thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ và Poly Clorua Biphenyl trong thuỷ sản

và sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký khí

Organochlorine pesticides and PCB-congeners in fish and fishery products - Method for quantitative analysis by Gas Chromatography

1 Phạm vi áp dụng

1.1 Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng các thuốc trừ sâu gốc Clo hữu cơ và Poly Clorua Biphenyl (sau đây gọi tắt là PCBs) trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản bằng hệ thống sắc ký khí (sau đây gọi tắt là GC).

1.2 Giới hạn phát hiện của phương pháp đối với: a-BHC là 1,0mg/kg; b-BHC là 4,5 mg/kg; g-BHC là 0,7 mg/kg; heptaclo là 1,0mg/kg; alđrin là 1,5 mg/kg; đielđrin là 2,5 mg/kg; enđrin là 5,0mg/kg; DDT là 1,5 mg/kg và clođan là 1,0mg/kg.

2 Phương pháp tham chiếu

Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp 'Rapid determination of chlorinated pesticides, polychlorinated biphenyls', Mitt.Lebendsmittelunters. Hyg. 65:131-150 (1974) và phương pháp số S9 nêu trong Sổ tay hướng dẫn phân tích dư lượng thuốc trừ sâu của Cộng hoà liên bang Ðức (năm 1987).

3 Nguyên tắc

3.1 Thuốc trừ sâu nhóm clo hữu cơ bao gồm các hợp chất chính hay đồng phân của chúng như sau: alđrin; a-clođan; g-clođan; oxi-clođan; p,p' DDD; p,p' DDE; o,p' DDT; p,p' DDT; đielđrin; a-endosulfan; enđrin; heptaclo, heptaclo epoxit; hexaclobenzen (HCB); a-hexacloxyclohexan (a-HCH); b-hexacloroxyclohexan (b-HCH); d-hexacloxyclohexan (d-HCH); isođrin, trans-nonaclo; g-hexachlorocyclohexan (g-HCH).

3.2 Các hợp chất nhóm PCBs bao gồm: 4-PCB (CB3); 2,4,4'-PCB (CB28); 2,2',4,4'-PCB (CB47); 2,2',5,5'-PCB (CB52); 2,2',5,6'-PCB (CB53); 2,2',4,5,5'-PCB (CB101); 2,3,4,4',5'-PCB (CB114); 2,3',4,4',5'-PCB (CB118); 2,3,3',4,5'-PCB (CB122); 2,2',3,3',4,4'-PCB (CB128); 2,2',3,4,4',5'-PCB (CB138); 2,3,3,4',5',6'-PCB (CB149); 2,2',4,4',5,5'-PCB (CB153); 2,2',4,4',6,6'-PCB (CB155); 2,3,3',4,4',5'-PCB (CB156); 2,3,3',4,4',5'-PCB (CB157); 2,3',4,4',5'-PCB (CB167); 2,2',3,3',4,4',5'-PCB (CB170); 2,2',3,4,4',5,5'-PCB (CB180); 2,2',3,3',4,5,5',6-PCB (CB198).

3.3 Trong mẫu thủy sản các hợp chất trên được chiết tách ra bằng dung môi pentan. Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên florisil sau đó được tách làm 2 phân đoạn trên cột silicagel. Phân đoạn A chứa các PCB (trừ CB3), HCB, alđrin, isođrine, heptaclo và p,p' DDE. Phân đoạn B chứa CB3, p,p' DDE và các thuốc trừ sâu gốc clo còn lại. Hàm lượng các thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ và PCBs trong các phân đoạn chiết được xác định trên máy sắc ký khí với đầu dò bắt giữ điện tử (sau đây gọi tắt là ECD).

4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.1 Thiết bị và dụng cụ

4.1.1 Cột sắc ký thủy tinh (có van khoá), kích thước L x ID là 500 x 20 mm và 500 x 8mm.

4.1.2 Hệ thống cô quay chân không.

4.1.3 Hệ thống chiết mẫu soxhlet.

4.1.4 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/phút.

4.1.5 Máy lắc

4.1.6 Tủ sấy

4.1.7 Lò nung

4.1.8 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.

4.1.9 Cột mao quản (cho máy GC): loại SPB^TM - SUPELCO, kích thước L x ID = 30 m x 0,32 mm hoặc tương đương.

4.1.10 Máy sắc ký khí với đầu dò ECD.

4.1.11 Hệ ống soxhlet: các ống soxhlet được làm sạch bằng cách chưng cất với pentan hay diclormetan trên hệ thống soxhlet trong 4 giờ.

4.1.12 Cối sứ.

4.1.13 Bể siêu âm

4.1.14 Bình thuỷ tinh, bình tam giác dung tích 50 ml.

4.2 Hoá chất

4.2.1 Ete đietyl loại dùng cho HPLC.

4.2.2 Pentan loại dùng cho HPLC.

4.2.3 Sulfat natri khan tinh khiết được làm sạch bằng điclometan trên hệ thống soxhlet, sau đó nung ở nhiệt độ 500⁰C trong 4 giờ và giữ trong chai thuỷ tinh.

4.2.4 Isooctan loại dùng cho HPLC.

4.2.5 Khí mang: Heli (loại dùng cho GC).

4.2.6 Florisil cỡ hạt từ 60 đến100 mesh được làm sạch bằng hệ thống soxhlet và nung ở nhiệt độ 450⁰C trong 18 giờ, sau đó cho vào chai thuỷ tinh được phủ bằng giấy nhôm và được giữ ở nhiệt độ 120⁰C trong tủ sấy.

4.2.7 Florisil được hoạt hoá: lấy một lượng florisil (4.2.6) từ tủ sấy đổ trực tiếp qua phễu vào một bình đáy tròn (erlenmeye) có nút nhám. Thêm vào bình 3 % nước theo tỷ lệ trọng lượng (w/w), sau đó lắc hỗn hợp khoảng 30 phút bằng máy lắc và để yên khoảng 1 giờ trước khi sử dụng.

4.2.8 Bông thuỷ tinh được làm sạch bằng pentan hay điclometan trên hệ thống soxhlet và để khô trên miếng giấy nhôm đặt trong tủ hút.

4.2.9 Cát sạch được nung ở nhiệt độ 500⁰C trong 3 giờ, để cho nguội trên giấy nhôm sau đó giữ trong chai có nắp vặn.

4.2.10 Silicagel cỡ hạt từ 70 đến 140 mesh.

4.2.11 Silicagel đã được hoạt hoá: lấy silicagel (4.2.10), rửa sạch bằng điclometan rồi cho vào trong chén sứ và để trong tủ sấy ở nhiệt độ 120⁰C trong vòng 12 giờ. Sau đó, dùng giấy thiếc bọc kín mệng chén sứ và để lại vào tủ sấy ở nhiệt độ 120⁰C trước khi sử dụng.

4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.3.1 Dung dịch rửa giải: hỗn hợp dung dịch điclometan và pentan (4.2.2) theo tỷ lệ về thể tích là 2 : 8, được pha trước khi sử dụng.

4.3.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn thuốc trừ sâu gốc clo và PCBs trong isooctan có nồng độ: 0,0 mg/l, 2,5mg/l , 5mg/l, 10,0 mg/l, 20,0 mg/l từ các ống chuẩn. Tuỳ theo nồng độ thuốc trừ sâu có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng isooctan thích hợp.

4.3.3 Dung dịch chuẩn thu hồi: pha các chuẩn của CB3, CB198 vàd-HCH trong dung môi isooctan để có hàm lượng là: 2,0 mg CB3/g isooctan; 0,2mg CB198/g isooctan và 0,2 mg d-HCH/g isooctan.

4.3.4 Dung dịch chuẩn kiểm tra: pha chính xác hỗn hợp dung dịch chuẩn kiểm tra gồm p,p DDE và ppDDT trong isooctan với hàm lượng của mỗi chất trong khoảng từ 5 đến 20 ng/ml isooctan.

5 Phương pháp tiến hành

5.1 Xác định hàm lượng chất béo trong mẫu thử

5.1.1 Nghiền đều 250,0 g mẫu thủy sản trên máy nghiền đồng thể (4.1.4). Dùng cân phân tích (4.1.8) cân chính xác 10,0 g mẫu (m) đã nghiền cho vào trong ống soxhlet sạch (4.1.11) được phủ bằng bông thuỷ tinh (4.2.8). Chiết mẫu với 150,0 ml pentan trong 3 giờ trên hệ thống chiết mẫu soxhlet (4.1.3).

5.1.2 Cô đặc dịch chiết trên máy cô quay chân không (4.1.2) đến khoảng 20 ml. Sau đó, cô tiếp ở chế độ chân không cho đến khi chỉ còn khoảng 1,0 ml.

5.1.3 Chuyển dịch đã cô vào một chén cân đã biết trước khối lượng, dùng giấy nhôm phủ lên chén cân rồi để qua đêm trong tủ hút. Sau đó, chén cân được làm khô đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 70⁰C trong tủ sấy (sự thay đổi của chén cân không vượt quá 0,0005 g) rồi để nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm. Phần thu được đem cân là lượng chất béo có trong mẫu.

5.2 Chuẩn bị mẫu thử

5.2.1 Cân chính xác 10,0 g mẫu (m) đã nghiền cho vào cối sứ (nếu lượng chất béo trong 10,0 g mẫu lớn hơn 0,8 g thì giảm lượng mẫu để đảm bảo có tối đa 0,8 g chất béo trong lượng mẫu đem thử nghiệm). Thêm 10,0 g cát sạch (4.2.9) và 4,0 g sunfat natri khan (4.2.3) rồi nghiền đều bằng cối sứ (4.1.12). Hỗn hợp được đưa vào trong ống soxhlet sạch (4.1.11), được phủ bằng bông thuỷ tinh (4.2.8). Sau đó, hỗn hợp được chiết với 150,0 ml pentan trong 3 giờ trên hệ thống chiết mẫu soxhlet (4.1.3).

5.2.2 Nếu mẫu chứa nước, sản phẩm chiết phải được lọc qua sunfat natri khan rồi được rửa lại bằng 25,0 ml pentan. Sản phẩm chiết được cô đặc trên máy cô quay chân không (4.1.2) đến khoảng 20 ml. Sau đó, cô tiếp với chế độ chân không ở nhiệt độ 40^oC cho đến khi chỉ còn khoảng 1,0 ml. Thêm vào dịch thu được 2,0 ml isooctane rồi làm sạch dịch chiết theo qui định tại Ðiều 5.5.

5.3 Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ và PCBs. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.2.

5.4 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi

Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn có hàm lượng 5,0 mg/l (4.3.2) vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.2.

5.5 Làm sạch dịch chiết

5.5.1 Chuẩn bị cột

5.5.1.1 Cân 25,0 g florisil đã hoạt hoá rồi cho vào cốc thuỷ tinh có mỏ chứa 50,0 ml dung môi pentan (4.2.2). Sau đó rót từ từ dung dịch vào trong cột sắc ký thuỷ tinh (4.1.1) đã khoá van và nhồi một ít bông thuỷ tinh (4.2.8) dưới đáy cột.

5.5.1.2 Ðể yên cột cho lắng, sau đó tháo van để rút dung môi pentan ra khỏi cột cho đến khi mức dung môi trong cột cao hơn mức florisil khoảng 1,0 cm. Thêm một ít bông thủy tinh lên phía trên lớp florisil để tránh xáo trộn tinh thể khi có dòng dung dịch đổ vào.

5.5.2 Làm sạch dịch chiết

5.5.2.1 Chuyển các dung dịch thu được ở Ðiều 5.2.2, Ðiều 5.3 và Ðiều 5.4 vào các cột sắc ký đã chuẩn bị (5.5.1).

5.5.2.2 Cho tiếp 3 lần, mỗi lần 3,0 ml dung dịch rửa giải (4.3.1). Ðiều chỉnh khoá để tốc độ rửa giải đạt từ 4 đến 5 ml/phút.

Chú thích: không được để khô cột trong tất cả các bước của qui trình.

5.5.2.3 Thu toàn bộ dịch chiết đi qua cột vào một bình thuỷ tinh đáy tròn của máy cô quay chân không (4.1.2). Tiến hành cô dung dịch thu được cho đến khi chỉ còn khoảng 1,0 ml. Bổ sung thêm 1,0 ml isooctan vào trong bình rồi lắc đều để hoà tan hết cặn bám trên thành bình. Làm bay hơi từ từ bằng dòng khí nitơ cho tới khi dịch khô hoàn toàn.

5.5.2.4 Thêm chính xác 2,0 ml isooctan rồi lắc đều để hoà tan cặn.

5.6 Phân tách thuốc trừ sâu gốc clo và PCBs

5.6.1 Chuẩn bị cột

5.6.1.1 Cân chính xác 7,0 g silicagel đã được hoạt hoá (4.2.11) vào trong bình định mức tam giác dung tích 50 ml (4.1.14). Sau đó, cho thêm khoảng 25,0 ml pentan, lắc đều rồi để cho lắng. Ðổ hỗn hợp này vào trong cột sắc ký thuỷ tinh kích thước L x ID là 500 x 8 mm (4.1.1) đã nhồi một ít bông thuỷ tinh (4.2.8) dưới đáy cột.

Chú thích: trong quá trình nhồi cột phải luôn giữ mức pentan trong cột cao hơn phần silicagel trong cột.

5.6.1.2 Ðể yên cho silicagel lắng xuống rồi bổ sung một lượng tinh thể sulfat natri (4.2.3) vào trong cột với chiều cao khoảng 2 cm. Mở khoá để tháo bớt pentan trong cột đến khi mức pentan ngang bằng với mặt trên của phần tinh thể sulfat natri.

5.6.2 Kiểm tra cột tách chiết silicagel và dung môi pentan

5.6.2.1 Lấy chính xác 2,0 ml dung dịch chuẩn kiểm tra (4.3.4) cho qua cột silicagel đã chuẩn bị (5.6.1). Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy khoảng 40 giọt/giây. Sau đó, cho từ từ 100,0 ml pentan qua cột. Thu lần lượt các dung dịch chiết chảy qua cột vào trong 9 bình thuỷ tinh (4.1.14). Bình thứ nhất (ký hiệu là E₁) thu 60,0 ml đầu, các bình tiếp theo (ký hiệu từ E₂ đến E₉) mỗi bình thu lần lượt khoảng 5,0 ml dịch chiết.

5.6.2.2 Cô quay các dung dịch trong 9 bình nói trên bằng máy cô quay chân không (4.1.2) cho đến khi còn khoảng 1,0 ml. Tiến hành phân tích trên máy sắc ký khí (GC-ECD) theo qui định tại Ðiều 5.6.3.2, Ðiều 5.6.3.3 và Ðiều 5.7. Tính hàm lượng của p,p'-DDE và p,p'-DDT tương ứng của mỗi bình theo công thức nêu tại Ðiều 6.

5.6.2.3 Xác định thể tích pentan cần thiết để thu được dung dịch rửa giải A (ký hiệu là X), bằng công thức sau:

X (ml) = E₁ + E₂ ... + E_n-1

Trong đó:

- E là thể tích dung dịch rửa giải thu vào bình có số thứ tự tương ứng, tính bằng ml.

- n là số thứ tự của bình mà tại đó không còn phát hiện p,p'-DDE

5.6.2.4 Giá trị X chỉ đúng với cùng một lô silicagel và pentan. Thông thường giá trị X nằm trong khoảng từ 60 đến 90 ml. Nếu hai hợp chất trong mẫu kiểm tra không thể phân tách được thì bổ sung thêm nước khoảng từ 1 đến 2 % về khối lượng vào silicagel trong cột rồi tiến hành lặp lại các bước kiểm tra qui định tại Ðiều 5.6.2.

5.6.3 Phân tách các dẫn xuất của PCB và thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ

5.6.3.1 Cho toàn bộ dịch chiết đã làm sạch (5.5.2) qua cột silicagel đã chuẩn bị (5.6.1). Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy khoảng 40 giọt/giây. Cho từ từ X ml pentan (xác định tại Ðiều 5.6.2) qua cột thu được dung dịch rửa giải A. Sau đó, cho tiếp 100,0 ml hỗn hợp ete đietyl và pentan theo tỉ lệ về thể tích là 1 : 9 đi qua cột thu được dung dịch rửa giải B. Sử dụng 2 bình chứa khàc nhau để hứng riêng 2 dung dịch A và B.

5.6.3.2 Thêm 1,0 ml isooctan vào các dung dịch rửa giải A, B. Dung dịch thu được được cô quay bằng máy cô quay chân không (4.1.2) cho đến khi còn khoảng 25,0 ml. Sau đó tiếp tục được cô cho đến dung dịch khô hoàn toàn.

5.6.3.3 Thêm chính xác 2ml isooctan (v) và đem phân tích trên máy GC.

Chú thích: không được để khô cột trong tất cả các bước của qui trình.

5.7 Tiến hành phân tích trên GC

5.7.1 Ðiều kiện phân tích

a. Máy sắc ký khí sử dụng đầu dò ECD, có khả năng chia dòng, có thể tuỳ chọn chế độ bơm tự động.

b. Chế độ nhiệt của hệ thống GC: Nhiệt độ của buồng tiêm là 250⁰C; nhiệt độ đầu dò là 300⁰C. Chương trình nhiệt độ (mô tả chi tiết trong Biểu đồ 1) cụ thể là:

- Duy trì ở nhiệt độ 150⁰C trong 1 phút.

- Tăng nhiệt độ 2⁰C/phút lên tới nhiệt độ 220⁰C.

- Tăng nhiệt độ 20⁰C/phút lên tới nhiệt độ 240⁰C.

- Duy trì ở nhiệt độ 240⁰C trong 13phút.

- Tổng thời gian là 51 phút.

c. Cột sắc ký

Cột mao quản không phân cực trung bình SPB -1^TM - SUPELCO (cột methylsilicon có khả năng tách thuốc trừ sâu theo nhiệt độ sôi), nhiệt độ tối đa 360⁰C, chiều dài 30 m, bán kính trong 0,32 mm, bán kính ngoài 0,50 mm, chiều dài lớp phủ 0,25 mm.

d. Khí

- Khí mang: Heliáp suất khí 70kpa.

- Khí làm sạch: Nitơ 99, 9999 %.

- Chế độ chia dòng: 1 :10.

5.7.2 Tiến hành phân tích

5.7.2.1 Tiêm các dung dịch chuẩn (4.3.2) vào máy GC theo thứ tự từ nồng độ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại thuốc trừ sâu theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b).

5.7.2.2 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch mẫu để xác định độ thu vào hệ thống GC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.

5.8 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích

5.8.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm

Ðộ lệch chuẩn (CV_S) tính theo diện tích píc sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.

5.8.2 Ðộ thu hồi (R)

Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu có cùng một lượng dung dịch chuẩn đã biết hàm lượng chính xác. Ðộ thu hồi tính được phải trong khoảng từ 85% đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %.

5.8.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R²) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.

6 Tính kết quả

Hàm lượng từng loại thuốc trừ sâu có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được ở (5.7.2.1). Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng từng loại thuốc trừ sâu có trong mẫu được tính theo công thức sau:

(Y - b)

C (mg/kg) = ------------ x F