28 TCN 179 : 2002 Hàm lượng aflatoxin - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hàm lượng aflatoxin trong sản phẩm thuỷ sản

- Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Aflatoxin in fishery products - Method for quantitative analysis by High Performance Liquid Chromatography

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1,5 mg/kg.

2 Phương pháp tham chiếu

Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp chuẩn số 49.2.05 của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) công bố năm 1997.

3 Nguyên tắc

Aflatoxin có trong mẫu thủy sản bao gồm các nhóm B1, B2, G1 và G2 được chiết tách ra bằng clorofom. Dịch chiết đựơc làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên silicagel. Hàm lượng aflatoxin có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn.

4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, chất chuẩn và dung dịch thử

4.1 Thiết bị, dụng cụ

4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang.

4.1.2 Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt từ 5 đến 10 [NAD1]mm.

4.1.3 Màng lọc mao quản kích thước 0,4 mm.

4.1.4 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/ phút.

4.1.5 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.

4.1.6 Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút.

4.1.7 Bể siêu âm.

4.1.8 Hệ thống cô quay chân không.

4.1.9 Cột thủy tinh có khóa teflon, kích thước L x ID là 500 x 20 mm và 500 x 8 mm.

4.1.10 ống ly tâm thủy tinh dung tích 250 ml.

4.1.11 Bình cầu thủy tinh dung tích 100 ml và 250 ml.

4.1.12 Bình định mức dung tích 5 ml và 10 ml.

4.2 Hóa chất

4.2.1 Nước cất loại dùng cho HPLC.

4.2.2 Metanol loại dùng cho HPLC.

4.2.3 Clorofom loại dùng cho HPLC.

4.2.4 Axetonitril loại dùng cho HPLC.

4.2.5 n-hexan tinh khiết loại dùng cho phân tích.

4.2.6 Ete etylic tinh khiết.

4.2.7 Sulfat natri khan.

4.2.8 Silicagel cỡ hạt từ 60 đến 200 mesh.

4.2.9 Silicagel đã được hoạt hóa: cân 50,0 g silicagel tinh khiết (4.2.8) để vào tủ sấy trong 2 giờ ở nhiệt độ 110^oC. Sau đó để nguội về nhiệt độ của phòng trong bình hút ẩm và ngâm trong clorofom 15 phút trước khi nhồi cột.

4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.3.1 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100,0mg/l), B2 (nồng độ 20,0 mg/l), G1 (nồng độ 100 mg/l) và G2 (nồng độ 20 mg/l).

4.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp aflatoxin có nồng độ (như Ðiều 4.3.1) trong metanol từ các ống chuẩn. Tùy theo nồng độ các aflatoxin có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng metanol thích hợp.

4.3.3 Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ là B1 (10,0mg/l), B2 (2,0 mg/l), G1 (10,0 mg/l) và G2 (2,0 mg/l): hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp (4.3.1) vào bình định mức 10 ml (4.1.12) rồi định mức tới vạch bằng metanol (4.2.2).

4.3.4 Dung dịch chuẩn: hút chính xác lần lượt 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.3.3) vào các bình định mức 10 ml (4.1.12) rồi định mức tới vạch bằng metanol. Các dung dịch chuẩn thu được có nồng độ aflatoxin lần lượt như sau:

a. Chuẩn 1 : B1 (0,0 mg/l), B2 (0,0 mg/l), G1 (0,0mg/l), G2 (0,0 mg/l).

b. Chuẩn 2 : B1 (1,0 mg/l), B2 (0,2 mg/l), G1 (1,0mg/l), G2 (0,2 mg/l).

c. Chuẩn 3 : B1 (2,0 mg/l), B2 (0,4 mg/l), G1 (2,0mg/l), G2 (0,4 mg/l).

d. Chuẩn 4 : B1 (4,0 mg/l), B2 (0,8 mg/l), G1 (4,0mg/l), G2 (0,8 mg/l).

đ. Chuẩn 5 : B1 (8,0 mg/l), B2 (1,6 mg/l), G1 (8,0mg/l), G2 (1,6 mg/l).

e. Chuẩn 6 : B1 (10,0 mg/l), B2 (2,0 mg/l), G1 (10,0mg/l), G2 (2,0 mg/l).

4.3.5 Dung dịch pha động: pha hỗn hợp các dung môi axetonitril, metanol và nước cất loại dùng cho HPLC theo tỉ lệ về thể tích là 2 : 2 : 6.

5 Phương pháp tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

5.1.1 Dùng cân phân tích (4.1.5) cân chính xác 50,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.1.10).

5.1.2 Thêm 100,0 ml clorofom (4.2.3) vào ống rồi trộn đều trong khoảng 2 phút bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm (4.1.6) trong khoảng 5 phút ở tốc độ 5 000 vòng/phút. Tiến hành lọc dịch chiết và rửa phần bã bằng clorofom rồi cho tất cả dịch thu được vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.1.11).

5.2 Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có aflatoxin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1.

5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi

Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn 3 (4.3.4.c) vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1. Phải chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi đồng thời với chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng.

5.4 Làm sạch dịch chiết

5.4.1 Chuẩn bị cột

Ðặt 1 lớp bông thủy tinh vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon (4.1.9). Ðóng khóa và cho clorofom tới khoảng 2/3 cột rồi thêm lần lượt 5,0 g sulfat natri khan (4.2.7), 20,0g silicagel đã hoạt hóa (4.2.8), 15 g sulfat natri khan (4.2.7).

Chú thích: để tránh khô cột luôn giữ mực clorofom cao hơn lớp sulfat natri khan trên cùng khoảng 1,5 cm.

5.4.2 Làm sạch dịch chiết

5.4.2.1 Cô dịch chiết thu được (5.1.2) trên hệ thống cô quay chân không (4.1.8) còn khoảng 5,0 ml ở nhiệt độ 40^oC. Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình cầu (5.1.2) vào cột làm sạch đã chuẩn bị (5.4.1) và tráng rửa bình cầu bằng clorofom. Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy của dung dịch ra khỏi cột khoảng từ 1,0 đến 1,5 ml/phút. Trong giai đoạn này, aflatoxin sẽ hấp phụ lên các hạt silicagel.

5.4.2.2 Thêm vào cột lần lượt 50,0 ml n-hexan (4.2.5), 50,0 ml ete etylic (4.2.6). Ðiều chỉnh tốc độ dung môi chảy qua cột ở 1,0 ml/phút. Sau đó loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột.

5.4.2.3 Giải hấp các aflatoxin khỏi cột làm sạch bằng 50,0 ml hỗn hợp clorofom và metanol theo tỉ lệ về thể tích là 97: 3 với tốc dộ 1,0 ml/phút. Hứng dung dịch chảy ra khỏi cột vào bình cầu dung tích 100 ml (4.1.11). Cô dịch thu được trên hệ thống cô quay chân không (4.1.8) ở nhiệt độ 40^o C cho đến khô hoàn toàn. Hoà tan cặn bằng 5,0 ml (V) dung dịch pha động (4.3.5) trong bình định mức 5 ml (4.1.12). Tiến hành phân tích hàm lượng các aflatoxin trên HPLC theo qui định tại Ðiều 5.5.

5.4.2.4 Tiến hành làm sạch mẫu trắng (5.2) và mẫu để xác định độ thu hồi (5.3) giống như với mẫu thử (5.1) theo qui định tại Ðiều 5.4.2.1, Ðiều 5.4.2.2 và Ðiều 5.4.2.3.

5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC

5.5.1 Ðiều kiện phân tích

a. Cột sắc ký : RP-LC 18, kích thước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt 5 -10 [NAD2]mm.

b. Nhiệt độ cột : 35^oC.

c. Pha động   : Hỗn hợp gồm: axetonitril, metanol và nước cất (4.3.5.

d. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang là: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm.

e. Thể tích tiêm : 20 ml.

5.5.2 Tiêm các dung dịch chuẩn (4.3.4) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại aflatoxin theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b).

5.5.3 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng và dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.

5.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích

5.6.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm

Ðộ lệch chuẩn (CV_s) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.

5.6.2 Ðộ thu hồi (R)

Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu trắng đã cho vào một lượng dung dịch aflatoxin chuẩn đã biết hàm lượng chính xác (5.3). Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %.

5.6.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R²) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.

6 Tính kết quả

Hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.5.2). Với đường chuẩn ở dạng y = ax +b, hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính theo công thức sau:

         

                                                    (Y - b)

           C (mg/kg) = ------------ x F

                                                        a

Trong đó:

- C là nồng độ aflatoxin có trong mẫu, tính theomg/kg

- Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích

- a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, được xác định theo Ðiều 5.5.2.

- F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V (5.4.2) và khối lượng mẫu m (5.1.1) sử dụng.